Biofisica a singola molecola nell’era dell’alta produttività
La capacità di studiare grandi librerie di sequenze di DNA, RNA e proteine a livello di singola molecola costituisce da tempo un obiettivo critico della biofisica, che promette di sbloccare nuove dimensioni della comprensione molecolare. «Consentendo ai ricercatori di esaminare le dinamiche e le interazioni delle singole molecole, tali studi fornirebbero una comprensione più approfondita dei processi biologici», afferma Chirlmin Joo(si apre in una nuova finestra), biofisico attivo presso il Politecnico di Delft(si apre in una nuova finestra). «Aprirebbero inoltre le porte allo sviluppo di nuovi metodi per trattare disturbi genetici, cancro e altre patologie.» A contribuire a superare questa annosa limitazione è il progetto MIGHTY_RNA, che ha ricevuto il sostegno del Consiglio europeo della ricerca(si apre in una nuova finestra) e si è incentrato su SPARXS, un’innovativa piattaforma che integra misurazioni di fluorescenza a singola molecola con tecniche di sequenziamento di nuova generazione allo scopo di consentire lo svolgimento di studi biofisici ad alta produttività e specifici a livello di sequenze. «Questa soluzione innovativa consente di effettuare la caratterizzazione cinetica e strutturale simultanea di milioni di molecole con migliaia di sequenze uniche», spiega Joo, accelerando la comprensione relativa alla loro forma e comportamento.
Superare le sfide
Lo sviluppo della piattaforma SPARXS ha imposto ai ricercatori la necessità di superare diverse sfide, tra cui quella di garantire la compatibilità tra il rilevamento di fluorescenza a singola molecola e i processi di sequenziamento sulla stessa cella a flusso commerciale per il sequenziamento. Inizialmente, i ricercatori non erano nemmeno sicuri che ciò avrebbe funzionato in quanto non avevano alcun controllo diretto sulle condizioni all’interno di una cella a flusso per il sequenziamento. «Per ottenere la fluorescenza a singola molecola [priva di rumore di fondo] in quell’ambiente è stato necessario ripensare le strategie di rilevamento da zero», osserva Joo. «Si è trattato di un importante passo in avanti, che ha reso possibile la realizzazione di SPARXS.» Inoltre, per allineare i vasti set di dati provenienti dalle modalità di microscopia a fluorescenza e di sequenziamento, il progetto ha dovuto sviluppare algoritmi personalizzati in grado di eseguire un accoppiamento preciso dei dati. I dataset, congiuntamente a tutti i software utilizzati nel progetto, sono apertamente accessibili(si apre in una nuova finestra).
Un esperimento, migliaia di sequenze uniche
Mediante l’impiego di SPARXS, i ricercatori hanno potuto studiare il comportamento cinetico di oltre 4 000 sequenze uniche di DNA effettuando un unico esperimento. Secondo Joo, questo lavoro non solo rivela nuove intuizioni sulla dinamica molecolare dipendente dalle sequenze, ma fornisce anche un quadro solido e generalizzabile che può essere applicato allo studio di proteine, RNA e altre biomolecole. «SPARXS apre nuove strade per la comprensione delle relazioni sequenza-struttura-funzione su una scala senza precedenti e vedere questo concetto concretizzarsi, testimoniandone la convalida a livello sperimentale, è stato un punto di svolta nella mia carriera», aggiunge.
Le modalità con cui le variazioni di sequenza influenzano il comportamento molecolare
Il progetto MIGHTY_RNA ha spinto i confini della biofisica a singola molecola nel dominio dell’alta produttività e intende continuare ad allargarli. I ricercatori sono attualmente intenti a espandere l’utilizzo di SPARXS oltre il regno degli acidi nucleici, adattandolo allo studio delle interazioni proteina-ligando e proteina-peptide. Per di più, il progetto sta esplorando la possibilità di integrare i dati ricavati da SPARXS con approcci fondati sull’apprendimento automatico, dando vita a una combinazione che potrebbe consentire alla piattaforma di prevedere le interazioni e le dinamiche molecolari, migliorandone in tal modo l’utilizzo nei campi della scoperta di farmaci e della biologia sintetica. «Attraverso la combinazione della risoluzione delle tecniche a singola molecola con la scala degli approcci ad alta produttività, la piattaforma SPARXS permette ai ricercatori di sondare sistematicamente il modo in cui le variazioni di sequenza influenzano il comportamento molecolare, con applicazioni che vanno dalla biofisica fondamentale alla ricerca biomedica traslazionale», conclude Joo. L’esperto accoglie richieste di informazioni(si apre in una nuova finestra) da potenziali collaboratori interessati ad applicare SPARXS ad altri sistemi biologici.
